Dag 4. Stringenstvätt och detektion

Idag har membranet som blottades blivit tvättat och hybridiserat med prober för att detekteras.
Metoden att detektera med probe kan användas på mycket små mängder av DNA, till skillnad från elektrofores som kräver större mängder för att kunna ses med UV-ljus.

Resultatet såg ut som följande efter inkubation i mörker:

I kolumnen längst till vänster finns den oklyvda plasmiden. Därefter kommer den klyvda plasmiden(5mikrogram) och längst bort finns den klyvda plasmiden (0,005 mikrogram).
De tjockaste banden i de två första kolumnerna är de som innehåller mest LL-37.
Det förekommer även lite ospecifika hybridiseringar av prober som inte blivit helt borttvättade i stringenstvätten, men utgör inget större hinder i bedömningen då banden med LL-37 är så starka i jämförelse.

Till skillnad från elektroforesen så är band synliga vid den lägsta koncentrationen av klyvd plasmid, vilket visar på att probe-detektion är väldigt effektiv även vid mindre mängder.

Vi har påvisat återigen att vi LL-37 genen.

Jag vill tacka min labbpartner för en väl utförd laboration med strålande resultat.

Dag 2. PCR och kontrollelektrofores

Idag har jag och min labbpartner utfört en PCR reaktion och en kontrollelektrofores för att verifiera att templatet vi amplifierat är LL-37 genen.

Resultatet av PCR var följande:

OBS! Det vita strecket är tryckfel tack vare skrivaren!!

Brunnen till vänster är den negativa kontrollen, följt av DNA Markör 3, följt av plasmidpreparationen, följt av templatprovet ( plasmiden som genomgått PCR), följt av DNA Markör 9 och längst till höger har vi den positiva kontrollen (känd LL-37-gen).

Vi kan konstatera att den negativa kontrollen är kontaminerad. Vi kan också konstatera att templatet som blev amplifierat är defenitivt LL-37 genen, jämförd med den positiva kontrollen.
Hos plasmidpreparationen ser två band, varav det bandet längst ner lyser starkast. Vi kan konstatera att vi inte har något RNA, då det skulle synas ett tredje band längre ner.
Vi kan också konstatera att vi inte har något protein i våran plasmidpreparation, då det skulle finnas ett tredje band högre upp. Det bandet som lyser starkast är  plasmiden DNA i Supercoil-form. Det andra bandet högre upp är även det plasmid DNA, dock i Open circle-form.
Anledningen att DNA:t gått från Supercoil-form till Open-Circle är att en liten del av DNA:t blivit skadad av mekanisk stress och fosfodiesterbindnigar släppt.

Trots att den negativa kontrollen blivit kontaminerad så kan man ändå konstatera att vi lyckats få fram LL-37-genen. Om det hade vart så att vi fått LL-37-genen på grund av en kontamination så skulle det bandet vara lika svagt som den negativa kontrollen. Men det är det inte, utan det lyser mycket starkare.
Därför leder det oss att tro att kontaminationen inte beror på dålig pipettering, utan att något i någon lösning som användes till PCR-förberedelsen redan var kontaminerat i förhand.
Under hela förberedelsen användes filterpipettspetsar  som byttes ut varje gång.
Vi jämförde även vårt resultat med en annan grupp som även dem hade haft rätt tillvägagångssätt men fått en kontaminerad negativ kontroll, väldigt lik våran.

Om vi jämför vårt templat med den positiva kontrollen så är banden lika och därför kan vi säga att vi lyckat få LL-37- genen. DNA-Markörerna visar att bandet ligger någonstans i storleksordningen på 600 baspar.

PCR som genomfördes var därför lyckad. Vi har påvisat att våran plasmidlösning är ren, och att plasmiden vi renat fram innehåller LL-37-genen.

Dag 1 - Rening av rekombinant plasmid

Då har min labbpartner och jag renat fram våran plasmid som (vilket vi sedan ska verifiera) har LL-37 genen som insert.

Vi har kortfattat lyserat bakterieceller (E.coli), renat och separerat celldebris från de plasmider som vi velat ha m.h.a QIAgen prep. Har vi gjort rätt så har vi förhoppningsvis renat bort så mycket föroreningar som möjligt.
Med föroreningar menas oönskad material, så som RNA kromosolamt DNA(vi vill ha plasmid DNA), proteiner och annat celldebris.

Efter att ha renat fram plasmiden så var det dags att koncentrationsbestämma den genom spektrofotomtri. Vi spädde plasmidlösningen 100 gånger för att sedan skanna den i spektrofotometern mellan våglängderna 230 nm-300nm.
Vid två våglängder, 260 och 280 noterades absorbansen ner.

Vid 260 har DNA:T sin absorbanstopp och 280 har RNA sin absorbanstopp. Genom att dividera absorbanserna uppmätta vid dessa två våglängder för vi en siffra, ett värde, som fungerar som en riktlinje för hur rent provet är.

Får man en kvot mellan 1,8 och 1,9 så är provet "rent". Får man en kvot lägre än 1,8 så kan det indikera att det finns protein i provet. Får man en kvot högre än 2 är det en indikation på att det möjligtvis finns RNA kvar i provet efter rening.

Vid första anblick av resultatet av våran rening, så är min labbpartner och jag väldigt nöjda med resultat. Vi hade en kvot på 1,84 och en beräknad koncentration 3,5 mikrogram/mikroliter.
Vilket labbhandledaren bekräftade var ett bra resultat.

Inledning

Denna blog går ut på att besvara frågor som har med laborationerna att göra.
Laborationerna är uppdelade under fyra dagar.
Momenten som ingår är:
Dag 1- Rening av rekombinant plasmid enl. Qiagen. Koncentrations och renhetsbestämning av plasmidprep
Dag 2- PCR för kontroll av insert, kontrollelektrofores på plasmidprep, respektive PCR. Klyvning av plasmid DNA med EcoR1.
Dag 3- Elektrofores av klyvt material och Southern Blot. Inmärkning av LL-37 gen med DIG-dUTP(random priming). Fixering av DNA till membran med UV bestrålning. Prehybridisering och hybridisering.
Dag 4- Stringenstvätt. Detektion.