Dag 2. PCR och kontrollelektrofores

Idag har jag och min labbpartner utfört en PCR reaktion och en kontrollelektrofores för att verifiera att templatet vi amplifierat är LL-37 genen.

Resultatet av PCR var följande:

OBS! Det vita strecket är tryckfel tack vare skrivaren!!

Brunnen till vänster är den negativa kontrollen, följt av DNA Markör 3, följt av plasmidpreparationen, följt av templatprovet ( plasmiden som genomgått PCR), följt av DNA Markör 9 och längst till höger har vi den positiva kontrollen (känd LL-37-gen).

Vi kan konstatera att den negativa kontrollen är kontaminerad. Vi kan också konstatera att templatet som blev amplifierat är defenitivt LL-37 genen, jämförd med den positiva kontrollen.
Hos plasmidpreparationen ser två band, varav det bandet längst ner lyser starkast. Vi kan konstatera att vi inte har något RNA, då det skulle synas ett tredje band längre ner.
Vi kan också konstatera att vi inte har något protein i våran plasmidpreparation, då det skulle finnas ett tredje band högre upp. Det bandet som lyser starkast är  plasmiden DNA i Supercoil-form. Det andra bandet högre upp är även det plasmid DNA, dock i Open circle-form.
Anledningen att DNA:t gått från Supercoil-form till Open-Circle är att en liten del av DNA:t blivit skadad av mekanisk stress och fosfodiesterbindnigar släppt.

Trots att den negativa kontrollen blivit kontaminerad så kan man ändå konstatera att vi lyckats få fram LL-37-genen. Om det hade vart så att vi fått LL-37-genen på grund av en kontamination så skulle det bandet vara lika svagt som den negativa kontrollen. Men det är det inte, utan det lyser mycket starkare.
Därför leder det oss att tro att kontaminationen inte beror på dålig pipettering, utan att något i någon lösning som användes till PCR-förberedelsen redan var kontaminerat i förhand.
Under hela förberedelsen användes filterpipettspetsar  som byttes ut varje gång.
Vi jämförde även vårt resultat med en annan grupp som även dem hade haft rätt tillvägagångssätt men fått en kontaminerad negativ kontroll, väldigt lik våran.

Om vi jämför vårt templat med den positiva kontrollen så är banden lika och därför kan vi säga att vi lyckat få LL-37- genen. DNA-Markörerna visar att bandet ligger någonstans i storleksordningen på 600 baspar.

PCR som genomfördes var därför lyckad. Vi har påvisat att våran plasmidlösning är ren, och att plasmiden vi renat fram innehåller LL-37-genen.